ADN RECOMBINANTE EN DIABETES MELLITUS

ADN RECOMBINANTE EN DIABETES MELLITUS 

En los últimos 100 años, el conocimiento de la genética ha crecido exponencialmente. Hoy en día, combinando el ADN de dos organismos distintos con la técnica del ADN recombinante, son posibles muchos resultados.

Las hormonas como la insulina son creadas en cuerpos que funcionan normalmente. Esta hormona es una proteína que está hecha de una secuencia específica de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos está determinada por el ADN de una persona. 

La insulina ayuda a controlar la cantidad de azúcar en sangre. Anteriormente, los diabéticos usaban insulina porcina y vacuna, pero no era bien tolerada por todos los pacientes ya que su secuencia de aminoácidos es levemente diferente. Ahora insulina humana puede ser producida en masa a través de procesos de ingeniería genética. 

La tecnología recombinante del ácido desoxiribonucleico (ADN) ha permitido el desarrollo de la insulina humana; sin embargo, esta no ha resuelto totalmente los problemas relacionados con la inmunogenicidad, entre otros problemas. Por tanto, las nuevas tecnologías son aplicadas para crear los análogos de insulina.

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ARTÍCULO ANALIZADO DE PCR

Efectividad de la metformina en pacientes con diabetes tipo II según variantes en el gen SLC22A1

Detección de polimorfismos en el gen slc22a1 

Se obtuvo el ADN de los pacientes de sangre periférica usando el equipo comercial Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se estudiaron 5 diferentes polimorfismos en el gen SLC22A1 (R61C, P341L, M420del, G401S y G465R), los cuales se analizaron mediante la técnica de PCR-RFLP (PCR-restriction fragment length polymorphism assay) usando primers específicos (diseñados por este equipo) en un termociclador MJ Research (Waltham, Massachusetts, EE.UU.).

La reacción de PCR se realizó usando 80 ng del ADN de los pacientes; 3 μL del buffer 5X de la enzima; 200 μM de cada dGTP, dATP, dCTP y dTTP; 10 μM de cada primer específico del polimorfismo Forward yReverse; 0.6 U de GoTaq polimerasa (Promega) y agua csp 15 μL. Los parámetros de ciclado fueron: 94 °C durante 2 min y luego 35 ciclos de 94 °C por 50 s, 58 °C por 50 s y 72 °C por 60 s y una extensión final a 72 °C por 5 min.

Los productos de amplificación fueron digeridos con endonucleasas de restricción específicas, luego separados por electroforesis en geles de agarosa (2,5% p/v) y visualizados por irradiación con luz ultravioleta luego de la tinción con bromuro de etidio.
Se tomaron 5 muestras al azar para ser analizadas por secuenciamiento del ADN, a fin de verificar si los resultados obtenidos por la técnica de PCR - RFLP eran coincidentes.

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ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

ASOCIACIÓN DEL SNP19 DEL GEN «CALPAÍNA 10» A DIABETES MELLITUS TIPO 2 Y FACTORES DE RIESGO EN POBLACIÓN PERUANA

Análisis molecular

A partir de una muestra de ADN, se realizó la amplifi cación de los SNP 19 (intrón 6), 43 (intrón 3) y 63 (intrón 13) del gen CAPN10 utilizando los protocolos de amplifi cación descritos por Evans et al.15 y que fueron los siguientes:

SNP-19 (CAPN10-g.7920 indel 32bp). Se realizó la mezcla de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en un volumen de 10 μL que contenía buffer de PCR 1X, 200 μmol de cada dNTP, 1,5 mmol de MgCl2, 5% de dimetilsulfóxido, 250 nmol de cada primer, 0,25 UI de AmpliTaq Gold® (Applied Biosystems) y 40 ng de ADN genómico. Las condiciones del protocolo de PCR fueron 94 ºC durante 12 minutos, 35 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 60 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 30 segundos, y 72 ºC durante 10 minutos. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa al 2%. El alelo 1 mostró dos repeticiones de una secuencia de 32 pb y el amplifi cado tenía un tamaño de 155 pb, y el alelo 2 presentó tres repeticiones que sumaban 187 pb.

SNP-43 (CAPN10-g.4852 G/A). Se realizó el protocolo de PCR en un volumen total de 10 μL que contenía buffer de PCR 1X, 200 μmol de cada dNTP, 1,5 mol de MgCl2, 0,25 UI de AmpliTaq Gold® (Applied Biosystems) y 40 ng de ADN genómico. Las condiciones de PCR fueron 96 ºC durante 12 minutos, 35 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 57 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 10 minutos. Los productos de PCR fueron separados en un gel de agarosa al 2%. El alelo 1(G) fue de 134 pb y el alelo 2(A) de 152 pb.

SNP-63 (CAPN10-g.16378 C/T). Las condiciones de PCR fueron similares a las del SNP-19, excepto en que la temperatura de alineamiento fue de 62 ºC. Los productos de PCR se digirieron con 2 UI de la enzima de restricción HhaI (NEB) en buffer plus NE4 1X y albúmina de suero bovino al 1X, a 37 ºC durante 2 horas. Luego, estos productos de digestión fueron separados en gel de agarosa al 2%. El alelo 1(C) fue de 162 pb y el alelo 2(T) de 192 pb.

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