ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

ASOCIACIÓN DEL SNP19 DEL GEN «CALPAÍNA 10» A DIABETES MELLITUS TIPO 2 Y FACTORES DE RIESGO EN POBLACIÓN PERUANA

Análisis molecular

A partir de una muestra de ADN, se realizó la amplifi cación de los SNP 19 (intrón 6), 43 (intrón 3) y 63 (intrón 13) del gen CAPN10 utilizando los protocolos de amplifi cación descritos por Evans et al.15 y que fueron los siguientes:

SNP-19 (CAPN10-g.7920 indel 32bp). Se realizó la mezcla de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en un volumen de 10 μL que contenía buffer de PCR 1X, 200 μmol de cada dNTP, 1,5 mmol de MgCl2, 5% de dimetilsulfóxido, 250 nmol de cada primer, 0,25 UI de AmpliTaq Gold® (Applied Biosystems) y 40 ng de ADN genómico. Las condiciones del protocolo de PCR fueron 94 ºC durante 12 minutos, 35 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 60 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 30 segundos, y 72 ºC durante 10 minutos. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa al 2%. El alelo 1 mostró dos repeticiones de una secuencia de 32 pb y el amplifi cado tenía un tamaño de 155 pb, y el alelo 2 presentó tres repeticiones que sumaban 187 pb.

SNP-43 (CAPN10-g.4852 G/A). Se realizó el protocolo de PCR en un volumen total de 10 μL que contenía buffer de PCR 1X, 200 μmol de cada dNTP, 1,5 mol de MgCl2, 0,25 UI de AmpliTaq Gold® (Applied Biosystems) y 40 ng de ADN genómico. Las condiciones de PCR fueron 96 ºC durante 12 minutos, 35 ciclos de 94 ºC durante 30 segundos, 57 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 30 segundos y 72 ºC durante 10 minutos. Los productos de PCR fueron separados en un gel de agarosa al 2%. El alelo 1(G) fue de 134 pb y el alelo 2(A) de 152 pb.

SNP-63 (CAPN10-g.16378 C/T). Las condiciones de PCR fueron similares a las del SNP-19, excepto en que la temperatura de alineamiento fue de 62 ºC. Los productos de PCR se digirieron con 2 UI de la enzima de restricción HhaI (NEB) en buffer plus NE4 1X y albúmina de suero bovino al 1X, a 37 ºC durante 2 horas. Luego, estos productos de digestión fueron separados en gel de agarosa al 2%. El alelo 1(C) fue de 162 pb y el alelo 2(T) de 192 pb.

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