Efectividad
de la metformina en pacientes con diabetes tipo II según variantes en el gen
SLC22A1
Detección de polimorfismos en el gen slc22a1
Se obtuvo el ADN de
los pacientes de sangre periférica usando el equipo comercial Wizard
Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, EE.UU.) siguiendo las
instrucciones del fabricante. Se estudiaron 5 diferentes polimorfismos en el
gen SLC22A1 (R61C, P341L, M420del, G401S y G465R), los cuales se analizaron
mediante la técnica de PCR-RFLP (PCR-restriction fragment length polymorphism
assay) usando primers específicos (diseñados por este equipo) en un
termociclador MJ Research (Waltham, Massachusetts, EE.UU.).
La reacción de PCR se
realizó usando 80 ng del ADN de los pacientes; 3 μL del buffer 5X
de la enzima; 200 μM de cada dGTP, dATP, dCTP y dTTP; 10 μM de cada primer específico
del polimorfismo Forward yReverse; 0.6 U de GoTaq
polimerasa (Promega) y agua csp 15 μL. Los parámetros de ciclado fueron: 94 °C
durante 2 min y luego 35 ciclos de 94 °C por 50 s, 58 °C por 50 s y 72 °C por
60 s y una extensión final a 72 °C por 5 min.
Los productos de
amplificación fueron digeridos con endonucleasas de restricción específicas, luego
separados por electroforesis en geles de agarosa (2,5% p/v) y visualizados por
irradiación con luz ultravioleta luego de la tinción con bromuro de etidio.
Se tomaron 5 muestras al azar para ser analizadas por secuenciamiento del ADN, a fin de verificar si los resultados obtenidos por la técnica de PCR - RFLP eran coincidentes.
Se tomaron 5 muestras al azar para ser analizadas por secuenciamiento del ADN, a fin de verificar si los resultados obtenidos por la técnica de PCR - RFLP eran coincidentes.
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